PCRと制限酵素 DNA操作の基礎
バイオテクノロジーの根幹はDNA を自在に切り・増やし・読む技術です。その中核をなすPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)と制限酵素を理解しましょう。
基本知識
PCR (Polymerase Chain Reaction): ごく微量のDNAを試験管内で指数関数的に増幅する技術。1983年、キャリー・マリスが発明しノーベル化学賞(1993年)受賞。
PCRの3ステップ(サーモサイクラーで繰り返す):
① 変性(94°C): DNA二重らせんを熱で1本鎖に解離。
② アニーリング(50〜65°C): 目的配列に相補的な短い一本鎖DNA(プライマー)を両端に結合させる。
③ 伸長(72°C): Taqポリメラーゼ(好熱菌Thermus aquaticus由来の耐熱性DNAポリメラーゼ)がプライマーから相補鎖を合成。
30サイクルで約10億倍(230≒109)に増幅。
制限酵素(制限エンドヌクレアーゼ): 特定の塩基配列(認識配列)を認識し、DNA二重鎖を切断する酵素。もともと細菌が外来DNAを分解する自己防衛機構。
例: EcoRI は 5'-GAATTC-3' を認識し、G↓AATTC の位置で切断する。切断面が付着末端(スティッキーエンド)を生じる酵素が多く、これが遺伝子組換えに利用される。
例題: 制限酵素 EcoRI は認識配列 GAATTC を切断する。ある遺伝子断片(500 bp)を EcoRI で切断したところ2本のバンド(300 bp・200 bp)が得られた。この断片内に EcoRI 認識配列はいくつあるか。またスティッキーエンドの塩基配列を答えなさい。
解答: 1か所の切断で500 bpが300 bp + 200 bpに分かれるため認識配列は1か所。スティッキーエンドは
解答: 1か所の切断で500 bpが300 bp + 200 bpに分かれるため認識配列は1か所。スティッキーエンドは
5'-AATT-3' の4塩基突出末端(付着末端)。
ポイント
- PCR=変性→アニーリング→伸長の3ステップ×30サイクル
- Taqポリメラーゼ=耐熱性・好熱菌由来
- プライマー=増幅したい領域両端の相補的短鎖DNA
- 制限酵素=特定配列を認識し切断(細菌の防衛機構)
- スティッキーエンド=付着末端。遺伝子組換えに利用
- PCR発明者=キャリー・マリス(1993年ノーベル化学賞)
練習
- PCRで耐熱性DNAポリメラーゼが必要な理由を説明しなさい。
- 制限酵素が生物学実験で重要な理由を「認識配列」「付着末端」の語を用いて説明しなさい。
- PCR 25サイクルで理論上何倍に増幅されるか。